醫(yī)械創(chuàng)新資訊
我心目中檢測技術(shù)史上的幾次革命性發(fā)明分別是基于抗原抗體特異性結(jié)合原理的免疫標記技術(shù)，PCR技術(shù)和測序技術(shù)。今天我們來聊聊PCR技術(shù)，按照PCR技術(shù)的演進，人們習慣性的將PCR技術(shù)劃分為三代：普通PCR技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。
一、普通PCR技術(shù)
(圖片來網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸原作者所有)
普通PCR的優(yōu)點基于毛細管電泳的PCR
針對普通PCR的缺點，一些廠家推出了基于毛細管電泳原理的儀器，將PCR擴增后電泳的步驟在毛細管中完成，靈敏度更高，可以區(qū)分幾個堿基的差異并且通過MAERKER可以計算出擴增產(chǎn)物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產(chǎn)物打開后放入儀器，仍然存在很大的污染風險。
毛細管電泳圖
二、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time?PCR ，qPCR）技術(shù)?熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。熒光定量PCR的發(fā)展史是一部ABI、羅氏和伯樂等巨頭的蕩氣回腸的斗爭史，感興趣的可以去查查。該技術(shù)是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術(shù)。
(圖片來網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸原作者所有)
qPCR的優(yōu)點?數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個數(shù)，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。
2006年，F(xiàn)luidigm公司第一個生產(chǎn)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統(tǒng)，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統(tǒng)，采用高密度的納升級微流控芯片技術(shù)，將樣本均勻的分配至20 000個單獨的反應(yīng)孔中。
?(圖片來網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸原作者所有)? ? ?
2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100 dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動下，將每個標準反應(yīng)體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液。
至此數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其核心原理都是有限稀釋，終點PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標準PCR反應(yīng)體系，平均分配成幾萬個PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個反應(yīng)中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應(yīng)，通過讀取熒光信號的有或無進行計數(shù)，經(jīng)過統(tǒng)計學泊松分布的校準進行絕對定量。
1.Bio-Rad QX200?微滴式數(shù)字PCR
伯樂QX200是一個很經(jīng)典的數(shù)字PCR平臺，基本的檢測流程：通過微滴生成儀生成20000個油包水微滴，在普通PCR儀上擴增，最后通過微滴讀取儀讀取每一個微滴的熒光信號。操作較為復(fù)雜，污染風險中。
2.新羿?TD1?微滴式數(shù)字PCR
新羿?TD1是一個國產(chǎn)的數(shù)字PCR平臺，基本的檢測流程：通過微滴生成儀生成30000-50000個油包水微滴，在普通PCR儀上擴增，最后通過微滴讀取儀讀取每一個微滴的熒光信號。該平臺的微滴生成和讀取都在專用的芯片中進行，污染的風險低。
4.ThermoFisher QuantStudio?3D?芯片式數(shù)字PCR
?ThermoFisher QuantStudio 3D是另一個經(jīng)典的芯片式數(shù)字PCR平臺，其基本的檢測流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在有20000個微孔的芯片上，將芯片放在PCR儀上擴增，最后將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號。操作較為復(fù)雜，整個過程在封閉的芯片中進行，污染的風險較低。
5.JN MEDSYS Clarity芯片式數(shù)字PCR
JN MEDSYS Clarity是一個較新的芯片式數(shù)字PCR平臺，其基本的檢測流程是：將反應(yīng)液加入到涂布器中，通過涂布器將反應(yīng)液均勻涂布在固定在PCR管中有10000個微孔的芯片上，反應(yīng)液通過毛細管作用進入芯片，將帶有芯片的PCR管放在PCR儀上擴增，最后將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號。操作較為復(fù)雜。污染的風險較低。
