引物設(shè)計：
引物（primer）：
是DNA復(fù)制的起始點提供3′-OH，由一小段單鏈DNA或RNA構(gòu)成。
DNA引物設(shè)計：
PCR引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，需要一對DNA引物，即正向引物（forwardprimer）和反向引物（reverseprimer）。正向引物是與DNA雙鏈中無義鏈結(jié)合的引物，而反向引物是與有義鏈結(jié)合的引物。
引物設(shè)計原則：
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引物與模板互補
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引物與引物間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)
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盡量避免引物在模板的非目的位點結(jié)合
探針設(shè)計
雜交探針（hybridizationprobe）:是人工設(shè)計的一段寡核苷酸，用于目的核酸的識別和檢測。根據(jù)檢測的需要，有些探針進行了標(biāo)記（如生物素、地高辛、熒光分子、辣根過氧化物酶等）。
探針類型：
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DNA探針：即一段DNA片段。早期主要用于Southern印跡雜交，通過克隆基因、限制性內(nèi)切酶獲得特定片段制備DNA探針。也可通過PCR擴增或人工合成獲得。
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RNA探針：指帶有標(biāo)記，能與組織內(nèi)相對應(yīng)的核苷酸序列互補結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。由于RNA是單鏈分子，它與靶序列的雜交反應(yīng)效率較高。目前RNA探針主要有3種類型：① 單鏈cDNA探針：它可通過RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得；② cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得；③ 寡核苷酸探針：以核苷酸為原料，通過DNA合成儀人工合成。
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肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有類多肽骨架的DNA類似物，PNA的主鏈骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。PNA可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。
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肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有類多肽骨架的DNA類似物，PNA的主鏈骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。PNA可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。
探針設(shè)計
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探針的設(shè)計對雜交檢測至關(guān)重要，它決定著檢測的特異性。探針與目標(biāo)核酸相互作用越強，探針檢測的特異性越高。
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影響檢測特異性最重要的因素是探針的長度。目前，根據(jù)探針寡核苷酸的長度，可以分為兩類：
長探針：其長度在500～5000 bp之間，靶序列上存在點突變或多態(tài)性也不影響其雜交檢測，因而特異性和敏感性都能得到保障。短探針：其長度小于500bp，它對點突變或多態(tài)性的檢測比較敏感。
探針標(biāo)記（probelabeling）：是在核酸分子中標(biāo)記信號分子用于檢測分析。探針的標(biāo)記方式主要有放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。其中32P是最常用的放射性標(biāo)記。
雜交條件優(yōu)化：
如何提高信噪比，達到最佳目標(biāo)核酸識別和檢測效果，需要對雜交條件進行優(yōu)化。
